鱼类取血方法

鱼类的血液,对病害学、分子生物学、形态学等方面的研究都意义重大。但用小型鱼类来做实验，取血是一个比较头痛的问题。我所知道的有三种取血方法：
(1) 在鱼臀鳍位置的侧线偏下进针插入尾静脉取血
(2) 在鱼臀鳍基部进针，碰到脊椎后微偏可插入尾静脉取血．
(3) 断尾取血：剪断尾柄，用注射器或毛细管取血．
使用注射器尾静脉取血,精确,无污染,效率高,还不会危害鱼的生命,因此是所有方法的首选。心脏取血的优点是量足,可作为尾静脉取血的辅助方法。但鱼是非死不可了。至于断尾取血,夹杂着体表黏液和水分,不值得推荐。另外，对于体长小于10cm的小鱼来说,断尾法根本无法收集血,血会成团地堵在脊椎处滴下不来。这时候采用小号的针头比如5号尾静脉取血,还是可以抽出血液的。5-6cm的小鱼,一般抽出血液大于200ul,对于分子生物学研究已足够了。体长小于5CM的鱼，断尾后可能没有血，可以轻压鳃部试试。
小型鱼最好用心脏取血，之前最好用麻醉的方法，建议使用MS222(Sigma公司有卖，价格比较贵)。然后剪开肌肉，注意剪刀尖向上方挑着剪以免扎破心脏。从围心腔找到心脏，在心脏的下方有一类似三角形的膜状区域，就是静脉窦了，我的习惯是右手拿针头从中间向左下扎针，因为左下和右下方都有回流血管，比较容易抽。
建议使用静脉注射时候用的那种针头，后面有一段塑料管然后才接注射器的，最好有一个人给你配合，帮你拉注射器，你只要控制针头方向，并且，拉注射器的时候，不能太用力，有个负压就可以，因为鱼的血液比较少，拉快了容易把静脉窦的膜吸在针头上。
另外麻醉还可以选择用丁香酚，感觉效果还可以。麻醉剂多多少少对鱼是有伤害的，所以可能的话不要麻醉为好。这需要较好的技术,而且还不能伤及鱼。
做的时候,可以带个手套(五保那种),也可以用混毛巾包一下.尽量避免用手直接接触鱼体,这样对鱼的伤害小,鱼也不易得病。经验不足的人,以为鱼掉几个鳞片不要紧,其实这样鱼很容易得病的,做实验过程中死鱼非常烦人。
下面以4月龄红笛鲷为例，简单叙述一下取尾静脉取血过程：


(1) 从鱼侧线下方约1厘米下针，斜向上扎，直到针头碰到脊柱。
从图a所示的腹部体侧进针(图中位置向下1cm),这样垂直碰到脊柱,微微将针头往回轻拉,即可以抽了,但是用力不要过猛,按照出血量控制力量,新手很容易掌握。
(2) 抽拉针管的吸柱，保持针管处于吸气状态，左右稍微移动一下针头，即可吸上血。整个过程不应超过30秒。(图a)
在小型鱼取血中比较关键，一定要保持针管处于吸气状态，在缓慢移动针头，这样容易取到血。
(3) 把鱼的一边肌肉解剖开，可以看到针头刚好扎在紧贴在脊柱下的尾静脉上。 (图b,c 红线示尾静脉)
有时在离心(较高速度，如10000RPM以上)后血会遇到血清凝结的问题，是由于纤维蛋白原混入所造成。有以下几个原因：
(1) 离心速度过高（130）。高速离心的时候，shear force剪切力会激活血小板，所以会导致纤凝，钙离子就会导致这样的凝固，主要是纤维蛋白原转化为纤维蛋白，交联而得。避免方法为：一般3000-5000rpm，5-8min足够了 。
(2) 标本静置时间不够，纤维蛋白原未完全沉淀。正常人血液常温下采集及放置后1/2~2h开始凝固，18~24h完全血块才完全收缩。所以最好将血液静置过夜。从取血，离心到取血清整个过程，切勿震荡到血液收集管。
(3) 离心时的温度：很多人离心时设的温度是4度，但4度的温度太低了，在4度的时候血小板会有部分的激活，原因可能是因为血小板上有温度敏感的受体，血小板低温的部分激活也叫priming。可以对离体的激动剂反应的阈值降低，换句话说就是血小板更容易被激活了。易导致纤凝。所以最好在22度以上离心。
(4) 肥胖及明显高脂血症的人体及动物血样也容易出现血清粘度增大或凝固，可能同其纤维蛋白原含量增高及凝固抑制因子减少有关。
下面一段是摘自林光华老先生在1979年的动物学报上发的文章.----鲫鱼的血液的研究.文中提到鲫鱼体上形成活体组织槽取血,可在较小的鲫体上采得较多的血量.方法如下:
活鱼固定于自制木槽,腹面向上,拭净头部腹面,用小解剖剪将头腹面中央从鳃盖游离部分开始处到鳃盖后缘的皮剪开,再将基舌骨连同附着在基舌骨上的一小部分肌肉一同剪去,然后,用钝头小镊顺着清出一沟,仔细清除此沟壁上的结缔组织槽,槽底为腹大动脉,槽两侧壁是与最内侧鳃叶相连的结缔组织薄膜.轻轻将槽拭净,便可采血,用18号针头从槽的远心端刺穿腹大动脉管壁,顷刻,即在组织槽内注满一槽血液.此时,即可及时采血,采血时间不宜过长,以防血液凝固,如一次穿刺的血量不够,可用脱脂棉再细心拭净组织槽,从第一次穿刺处的近心端再穿一下,又可获得一槽血液,如此重复可穿刺5~6次.
还可从肝脏的静脉管取血，用左手压住肝脏，可见静脉管，右手进针，血量绝对不少，一个人操作都能搞定。
有些新手从心脏采血时,有时血一进入针筒就凝固。但鱼类的血液一般都是抽出来后十几秒才开始凝的。所以这种情况可能是操作不够熟练吧，也可能是鱼血比较难取，断断续续地，容易凝固。避免方法不难，抽血前先往针筒里加入ACD抗凝剂就行了。如果是提DNA，这是《分子克隆》一书中推荐使用的抗凝剂。使用肝素抗凝会抑制PCR反应，最好别用。
ACD与血液的比例一般在1：6~1：5之间，如常用的2.5ml一次性注射器，抽血先往针筒加0.5ml ACD。
配方：柠檬酸0.48g 柠檬酸钠1.32g 右旋葡萄糖1.47g 加水至100ml。