植物抗污染分化进化研究进展及其分子生物学技术的应用

　长期以来人们凭借形态特征和数量变化来进行植物抗污染生态分化研究，但对许多深入的研究却无能为力。目前，分子生物学技术日趋成熟并已大量运用于污染进化生态学研究中。这些技术的引入为传统分化进化研究打开了新局面，为进一步从本质上揭示污染条件下植物进化提供了可能。只有将分子生物学技术引入植物抗性进化研究中，将宏观与微观结合起来我们才有可能使许多问题得以解决[19]。同工酶、等位酶电泳技术的完善，作为第一代分子生物学标记的RFLP技术，以及近年来PCR技术的成熟和RAPD技术在国内外迅速发展，为实现上述研究提供了迅捷可靠的工具。

2.1 同工酶电泳技术
同工酶作为基因产物的蛋白质，其结构的多样性在一定程度上反映出不同种群在不同污染历史条件下分化进化上DNA组成和生物体遗传多样性。同工酶之所以作为分化进化的重要研究对象，首先是因为它在品种间有丰富的多样性。目前一半以上的酶类存在同工酶类。其次，同工酶易于检测出。同工酶虽然由单拷贝基因编码，但通过酶染色放大作用同样易于检测出。
等位酶作为一种特殊形式的同工酶，它由一个基因位点、不同等位基因编码。根据等位酶谱带的遗传分析确定出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的遗传相似度或遗传距离，再根据遗传距离分析植物对污染的适应过程中遗传结构变化，依据分子钟进化理论计算出遗传进化的理论时间，从而评估污染对植物进化影响的速度和强度[8、14]。目前的研究结果表明，经历污染时间越长，居群间的遗传相似系数就越小[5,14,21]
　　Mejnartowicz[24]利用同工酶技术发现受氟化物、SO2污染的苏格兰松F1代某些基因和基因型大为减少，Muller-Starck等[22]利用同工酶技术研究表明欧洲山毛榉同工酶平均每个位点基因数目随污染而下降，Scholz等[23]检测了挪威云杉对SO2敏感性各不相同的一系列无性系的若干同工酶位点，也证明一定量的遗传信息有因污染而丧失的危险性[20-22]。但是，由于种群杂合性影响，某些同工酶分析显示了相互矛盾的结果， 这表明同工酶技术所揭示的与污染胁迫的植物遗传变异的复杂性[3、15、21、25]。
2.2 RFLP技术
　　RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma,限制性内切酶片段长度多态性)作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它运用于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DNA，则可直接从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。
与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD 而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的[26]。
2.3 PCR技术
　　PCR(Ploymerase Chain Reactions,聚合酶链式反应)自80年代中期问世以来，以其快速、简便、灵敏、特异等特点受到分子生物学界极大青睐，已广泛用于基因工程、临床检验、环境生物监测以及进化生态学中核酸水平的基因多态性等研究领域。
　　PCR由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸三部反应构成一个扩增循环，使目的DNA片段得以迅速扩增。这一技术能选择性富集一个特异DNA序列，并成106扩增。PCR 扩增技术与RFLP结合使用其用途更为广泛，PCR技术主要优点有：①PCR与DNA测序结合，扩增后无需再克隆，纯化即可直接测序。②可扩增一个只知基因一侧或两侧碱基序列的基因。 ③可进行DNA多种突变的测定，如碱基互换、缺失、插入型突变[16]。PCR 近几年已逐渐引入到植物抗污染进化研究领域中，并表现出强大的应用潜力。
2.4 RAPD技术
　　1990年Williams和Welsh等[27、28]运用随机扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记， 并将此法命名为RAPD法(Random Amplified Polymorphism DNA,随机扩增多态性DNA) 。尽管RAPD技术诞生时间不长，但由于其独到的DNA 多态性及快速和比PCR更简便等特点，使它成为基因组遗传图谱构建；基因定位及进化生态学研究中最为重要手段之一。
　　RAPD与PCR、RFLP、DNA指纹图技术相比，它有如下特点：①RAPD 技术可在对受试物种缺乏任何分子生物学研究背景下，直接对基因组进行多态性分析。②操作简单；一次 RAPD扩增实际就是一次简单的PCR反应，适合大量的样本快速分析。③所需模板DNA量极少； 一般一次扩增只需10-50ngDNA，这对于濒危动植物的基因组分析是十分有效的[27、29-31]。④与RFLP相比，RAPD可免去探针克隆与分离过程，不需进行DNA序列分析。⑤RAPD同时适用于基因组的单拷贝区域或重复序列区。